●使用時に ii）NBT保存液 6.5μL、iii）BCIP保存液 5μLを混合し，i）100mMトリス塩酸緩衝液1.5mLを加え基質溶液とする。 i ）100mMトリス塩酸緩衝液（pH 9.5, 含100mM NaCl, 50mM MgCl2）（冷蔵保存） ①1Mトリス塩酸緩衝液（pH 9.5）：Tris（hydroxy-methyl）amino-methane 6.06gを精製水25mLに溶解させ、塩酸にて pHを9.5に調製し、精製水で50mLにメスアップする。 ②5M NaCl 水溶液：NaCl 2.93gを精製水10mLに溶解する。 ③1M MgCl2 水溶液：MgCl2 3.01gを精製水25mLに溶解する。 ④①②③を混合し、精製水で500mLにメスアップする。 ii）NBT（Nitro Blue Tetrazolium）保存液（-20℃保存） ・NBT（SIGMA）75mgを70％ N,N-ジメチルホルムアミド1mLに撹拌溶解する。 iii）BCIP（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphate-p-Toluidine salt）保存液（-20℃保存） ・BCIP（SIGMA）50mgをN,N-ジメチルホルムアミド 1mLに撹拌溶解｡ 免疫組織化学染色試薬ヒストファイン●②ニューフクシン溶液、③4％ 亜硝酸ナトリウム水溶液を100μLずつ等量混合し、1分放置。この液に④0.2Mトリス塩酸 緩衝液 40mLを加え、さらに撹拌しながら、①基質溶液 100μLを溶解する。濾過後すぐに使用する。（用時調製） i）基質溶液（用時調製） ①naphthol AS-BI phosphoric acid（SIGMA）10mgをN,N-ジメチルホルムアミド100μLに溶解する。 ii）カップラー液 ②ニューフクシン溶液：New fuchsin powder（MERCK）4.0gを2N塩酸 100mLに溶解し、濾過する。（冷蔵保存） ③4％ 亜硝酸ナトリウム水溶液：亜硝酸ナトリウム 40mgを精製水1mLに溶解する。（用時調製） iii）0.2Mトリス塩酸緩衝液（pH8.2〜8.3）（常温保存） ④Tris（hydroxy-methyl）amino-methane 12.12gを精製水250mLに溶解し、塩酸にてpHを8.2〜8.3に調製し、精製水 で500mLにメスアップする。●下記を溶解、混合、撹拌し、基質溶液とする。（用時調製） i ）3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride（DOJINDO）10mg ii）0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH 7.6，含15mM NaN3）50mL iii）5％ 過酸化水素水 50μL iv）イミダゾール 34mg ※2 ニューフクシン基質溶液調製法※3 DAB基質溶液調製法49◆参考●1回目の第一抗体の反応時間を4℃、一晩とし、2回目、3回目の第一抗体の反応時間を37℃、1時間とした場合、 本操作全てを2日間で行うことができます。◆試薬※1 BCIP/NBT基質溶液調製法
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